又稱為分子排阻層析（Size Exclusion Chromatography SEC）。凝膠顆粒內部呈網狀結構。待分離的物質中，分子量大的分子無法進入凝膠顆粒網狀結構的小孔穴內，它會從凝膠顆粒的間隙里通過，因此流出速度快；分子量小的分子會進入凝膠顆粒網狀結構的小孔穴中穿行，因此流出速度慢。因此，它是根據待分離物質的分子量大小不同、在凝膠內流過的速度存在差異而進行分離的。它多應用于多肽、多糖、核酸、蛋白質、病毒、細胞等的分離純化，此外，還廣泛應用于生物樣品的除鹽和緩沖液的交換。